饲料中包括大量植物生物质，对其高效降解有利于营养物质的释放和畜禽生长。针对植物生物质酶解效率低、成本高、应用范围较为单一的特点，申请人从降解酶的“质”、“量”、“新”三方面进行工作，取得如下创新成果：

1. “质”-揭示利用植物生物质降解酶的新机制：针对多功能植物多糖降解酶开展了研究，获得了第一个能降解微晶纤维素的10家族木聚糖酶，以其为模型进一步证明底物杂泛性在10家族木聚糖酶中普遍存在，为发掘双功能饲用纤维素酶/木聚糖酶、降低饲用酶制剂成本奠定了理论基础;对多结构域双功能糖苷水解酶开展了系统的研究，证明了此类特殊的结构域组织形式赋予酶以卓越的催化效率。据此构建的新酶赋予酿酒酵母效降解、利用微晶纤维素的能力，可以此新型生物平台生产高附加值饲用化学品;以乳白耙菌为研究对象阐明了木质纤维素选择性分步降解的分子机制，揭示了锰过氧化物酶和自由基的重要作用;

2. “量”-构建里氏木霉高效表达系统：使用表面展示技术并结合流式分选，建立了里氏木霉高产菌株的高通量筛选技术，可快速、准确地从诱变库或基因工程菌中得到产酶能力提高的菌株;通过过表达高比活b-葡萄糖苷酶内生槐二糖诱导剂建立了新型诱导产酶发酵技术;建立了正反馈调控技术、生物传感器调控技术、定向进化技术、菌丝形态发育调控技术;发现了蛋白激酶等多个促进纤维素酶基因转录和分泌表达的新调控因子;在里氏木霉中成功表达了葡萄糖氧化酶、甘露聚糖酶等多种饲用酶，使得里氏木霉可作为共表达两种甚至多种饲用酶的高效表达微生物平台，为多功能饲用酶的推广使用打下良好的基础。综合上述技术，提高里氏木霉生产纤维素酶的能力至35 mg/ml，达到国内先进水平，具有良好的应用前景。

3. “新”-拓展植物生物质降解酶应用于霉菌毒素广谱脱毒。发现木质素降解酶锰过氧化物酶(MnP)能降解黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马菌素等多种毒素，进而揭示这种广谱降解毒素的能力普遍适用于MnP家族蛋白;开创了使用染料来快速筛选MnP对毒素降解能力的评估方法，使研究人员在研究过程中规避了受到霉菌毒素侵害的风险;建立了漆酶降解黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等多种毒素的通用、简便、高效方法，实现了真菌和细菌来源的漆酶在毕赤酵母和里氏木霉中的重组高效表达，为将木质素降解酶用于饲料霉菌毒素酶法脱毒奠定了良好的理论和应用基础，具有重要的社会经济价值。

一、代表论文：

1. Xing Qin, Xianhua Sun, Huoqing Huang, Yingguo Bai, Yuan Wang, Huiying Luo, Bin Yao*, Xiaoyu Zhang*, Xiaoyun Su*. Oxidation of a non-phenolic lignin model compound by two Irpexlacteus manganese peroxidases: evidence for implication of carboxylate and radicals. Biotechnology for Biofuels, 2017,10:103. IF=6.444

摘要：

研究背景：

锰过氧化物酶是一类II型真菌过氧化物酶，能氧化低氧还电势的酚型木质素化合物。对于高氧还电势的非酚型木质素降解，必须需要还原型谷胱甘肽或不饱和脂肪酸等作为介体才能反应。迄今尚不知晓是否羧酸类物质能作为介体参与锰过氧化物酶降解非酚型木质素。

实验结果：

白腐真菌乳白耙菌是降解木质纤维素和异生物质最有效的一种真菌。本研究中，在大肠杆菌里表达了两个锰过氧化物酶(IlMnP1和IlMnP2)并成功的将其变性、复性。IlMnP1和IlMnP2都能有效的氧化酚型木质素;令人惊奇的是，它们还能以依赖于锰离子的方式来降解非酚型的木质素模型化合物藜芦醇。丙二酸和草酸是反应所必须的成分。进一步，通过LC-MS/MS确定了酶对非酚型木质素的降解。我们还证明，锰离子和一种特定的有机酸是氧化所必须的，而且反应中所产生的自由基，尤其是超氧离子自由基，至少是部分的决定了该酶对木质素的氧化降解。IlMnP1和IlMnP2还能对不同结构的染料进行脱色。

结论：

我们证明羧酸可以通过自由基的作用来介导酶对非酚型木质素的氧化。MnP，而不是LiP、DyP，是乳白耙菌和某些选择性木质纤维素降解菌如虫拟蜡菌分泌的主要过氧化物酶。我们的发现有助于理解这些真菌如何利用MnP和分泌的有机酸代谢物来有效的降解非酚型木质素。IlMnP1和IlMnP2独特的特性也使得这两个酶可作为研究锰过氧化物酶降解非酚型木质素的很好模型，在木质纤维素降解和环境修复上有重要的应用价值。

关键词：乳白耙菌;锰过氧化物酶;非酚型木质素;藜芦醇;染料脱色;羧酸;生物燃料

课题：国家重点研发计划(2016YFD0501409-02)，国家自然科学基金(31672458)

研究方向：拓展植物生物质降解酶应用于霉菌毒素广谱脱毒。

2. Xiaoyun Su, Vinayak Agarwal, Dylan Dodd, Brian Bae, Roderick I. Mackie, Satish K. Nair, and Isaac K. O. Cann. Mutational insights into the roles of amino acid residues in ligand binding for two closely related family 16 carbohydrate binding modules, Journal of Biological Chemistry, 2010,285(45): 34665-34676. IF=5.328

摘要：

碳水化合物结合结构域(CBMs)是专门结合多糖和寡糖的蛋白。耐热细菌Caldanaerobiuspolysaccharolyticus Man5ACBM16-1/CBM16-2能结合以葡萄糖-、甘露糖-和葡萄糖/甘露糖-等构型进行连接的多糖底物。这两个CBMs的三维结构是第16家族CBMs里仅有已知结构的两个蛋白，尚无研究对它们结合底物的关键残基进行研究。本研究探索了两个蛋白中和底物结合相关的关键残基，由此发现两个色氨酸(W20和W125))和两个谷氨酰胺(Q81和Q93)残基对底物结合最为关键。此外，关键残基两侧的一些极性氨基酸也对配体结合发挥了作用。CBM16-1 Q121E突变对所有构型底物的亲和力均增加，而Q21G和N97R则亲和力下降。进一步，对突变体Q121E和底物的复合物进行了晶体结构解析;能通过操纵Q121、Q21和N97残基调整这两个CBMs和底物结合的方式。令人惊奇的是，本研究所发现的8个和底物结合相关的关键氨基酸在第16家族的CBM中不保守，意味着这些残基可能对本家族中其它CBMs结合底物不重要，或者当前所研究的两个CBMs和本家族中的其它CBMs亲缘关系较为疏远。由于Man5A依赖于CBMs来发挥其高效催化的活性，因此，本研究所得将为改进该酶提供直接的理论依据。

关键词：Caldanaerobiuspolysaccharolyticus;碳水化合物结合结构域;16家族;甘露聚糖;纤维素

课题：美国能源生物科学实验室项目

研究方向：揭示利用植物生物质降解酶的新机制

3. Xing Qin, Xiaoyun Su*, Huiying Luo, Rui Ma, Bin Yao*, Fuying Ma*. Deciphering lignocellulose deconstruction by the white rot fungus Irpexlacteus based on genomic and transcriptomic analyses. Biotechnology for Biofuels, 2018,11:58. IF=5.203

摘要：

研究背景：

乳白耙菌是用来预处理木质纤维素的最重要的一种白腐真菌。为了解析它高效降解木质纤维素的分子机制，采用基因组、转录组学的方法来对使用球磨玉米杆作为碳源、液体培养的乳白耙菌进行研究。

实验结果：

培养9天后，乳白耙菌能将74.9%的木质素、86.3%的纤维素和83.5%的半纤维素降解。期间，锰过氧化物酶(MnP)被快速诱导，其后是纤维素酶和半纤维素酶的累积。基因组分析显示，该菌具有完整的一套木质纤维素降解的酶基因，主要包括II类过氧化物酶、染料脱色过氧化物酶、辅助酶系以及182个糖苷水解酶。比较转录组学分析证实了对木质纤维素的选择性降解这一模式。分析还显示来源于MnP-有机酸相互作用或芬顿反应所产生的自由基也在木质纤维素降解中发挥了重要作用。

结论：

乳白耙菌具有选择性降解的模式，与之相伴的是胞外极低的beta-葡萄糖苷酶的活性，这些特性解释了为什么该菌可用于高效的木质纤维素预处理过程。我们的研究还暗示自由基在未来设计新的木质纤维素酶中可能会起到的重要作用。

关键词：乳白耙菌;木质纤维素;转录组学;锰过氧化物酶;自由基

课题：国家重点研发计划(2016YFD0501409-02)

研究方向：揭示利用植物生物质降解酶的新机制

4. Yindi Chu#, Tao Tu#, LeenaPenttinen, XianliXue, Xiaoyun Wang, Zhuolin Yi, Li Gong, JuhaRouvinen, Huiying Luo, Nina Hakulinen*, Bin Yao*, Xiaoyun Su*. Insights into the roles of the non-catalytic residues for a GH10 xylanase with cellulase activity. Journal of Biological Chemistry. 2017, 292(47):19315-19327. IF=4.125

摘要：双功能糖苷水解酶在节约酶解植物细胞壁多糖的成本中具有很大的潜力。Caldicellulosiruptorbescii的双功能多结构域酶CbXyn10C/Cel48B的N端GH10结构域能同时降解木聚糖和纤维素。然而，它的底物杂泛性的机制尚不清楚。本文使用ITC技术，揭示了CbXyn10C对木寡糖和纤维寡糖至少具有6个糖结合单元并进一步通过测定对寡糖的催化效率确认。通过X射线衍射、分子模拟和建模获得了CbXyn10C及其和木寡糖、纤维寡糖的晶体结构。CbXyn10C的结构为典型的GH10家族结构，呈(β/α)8–TIM桶状。在和木寡糖的复合物结构中发下了7个糖结合单元和许多与之相关的结合残基。突变研究发现对木聚糖和纤维素水解，分别有6个和10个关键的残基。最重要的残基位于接近切割位点的-2和-1糖结合单元之间，而具有中等重要性的残基则位于底物结合口袋中较远区域。直接或间接的操控和底物相互作用的、远端的残基能够改善该酶对木聚糖和纤维素的催化活性。绝大多数和纤维素酶活性相关的关键残基均在第10家族的木聚糖酶中保守，而且，随机选择的GH10酶都能发现以前未曾报道过的纤维素酶活性，说明具有双功能的木聚糖酶可能比人们所预想的要更为普遍存在。

关键词：木聚糖酶;纤维素酶;10家族糖苷水解酶;双功能酶

课题：国家自然科学基金(31672458)

研究方向：揭示利用植物生物质降解酶的新机制

5. XianliXue, Yilan Wu, Xing Qin, Rui Ma, Huiying Luo, Xiaoyun Su*, Bin Yao*. Revisiting overexpression of a heterologous β-glucosidase in Trichodermareesei: the Neosartoryafischeri Bgl3A enhances the overall as well as individual cellulase activities. Microbial Cell Factories, 2016,15:122. IF=4.220

摘要：

研究背景：

丝状真菌里氏木霉能分泌大量的纤维素酶，广泛应用于酶制剂的工业生产。但是，里氏木霉纤维素酶的beta-葡萄糖苷酶活性较低，这会导致水解反应中纤维二糖产物的集聚，抑制内切和外切酶的活性。通过过表达beta-葡萄糖苷酶基因，预期里氏木霉的纤维素酶能将纤维素更有效的降解为葡萄糖。

实验结果：

从Neosartoryafischeri选择了耐热的beta-葡萄糖苷酶NfBgl3A基因在里氏木霉中进行过表达，该酶具有较强的水解活性。在体外，毕赤酵母表达的NfBgl3A有助于里氏木霉的纤维素酶从微晶纤维素中释放更多的葡萄糖，减少了纤维二糖的积累。因此，将NfBgl3A基因融合于cbh1结构基因的下游，使用cbh1启动子驱动其表达。将重组质粒转化里氏木霉TU-6菌株，得到的转化子其beta-葡萄糖苷酶的活性为2.3~69.7 U/mL，最高可达野生型的175倍。不同转化子中的beta-葡萄糖苷酶活性有所不同，原因可能为基因的拷贝数和整合位点差异。里氏木霉表达的NfBgl3A在生化性质上和毕赤酵母中所表达的非常相似;因此，在里氏木霉中国表达的NfBgl3A也提升了整体的纤维素酶酶活。从分解酶活来看，所有转化子中的CBHI的活性都提升了，可能是因为增加了额外拷贝数的cbh1基因;而在三个转化子中的内切酶活性有所上升，这和所有以前过表达beta-葡萄糖苷酶的报道不一致。NfBgl3A具有明显的转糖苷活性，可以从葡萄糖和纤维二糖中产生槐二糖这种强的纤维素酶表达诱导剂。

结论：

成功的在里氏木霉中表达了beta-葡萄糖苷酶。同时，将NfBgl3A融合于cbh1基因额外的引入了更多拷贝数的纤维二糖水解酶。因此，我们观察到了beta-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶以及整体纤维素酶酶活的提高。同时，内切酶在某些菌株中的表达也有所升高。本研究成果有助于设计更高效生产纤维素酶的里氏木霉工程菌。

关键词：里氏木霉;纤维素酶;b-葡萄糖苷酶;DNA组合器;Neosartoryafischeri

课题：中国农业科学院青年英才计划

研究方向：构建里氏木霉高效表达系统。

二、新技术成果：

三、发明专利：